CICLO CELLULARE MITOSI E MEIOSI PDF

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Author: Tek Dum
Country: Botswana
Language: English (Spanish)
Genre: Life
Published (Last): 23 August 2013
Pages: 277
PDF File Size: 12.98 Mb
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ISBN: 297-7-88254-132-6
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Contemporaneamente abbiamo cellulate la dinamica dei processi a valle in goccioline individuali utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse multi-canale cellulade oscillatore mitotica. Il sistema di ciclo cellulare artificiale fornisce un framework di alto-rendimento per manipolazione quantitativa e l’analisi delle oscillazioni mitotiche con cella singola ad alta risoluzione, che probabilmente fornisce importanti intuizioni la regolamentazione macchine e funzioni di l’orologio.

Questi studi dei cicli cellulari usando gli estratti di uovo di Xenopus sono principalmente basati su misurazioni di massa. Tuttavia, analisi di reazione di massa convenzionale non possono imitare i comportamenti reali delle cellule, dati una discrepanza di maggiore dimensioni e subcellulare compartimentalizzazione spaziale delle molecole di reazione.

In questo sistema, sono stati mitotiche oscillazioni tra cui condensazione cromosomica e de-condensazione, ripartizione busta nucleare e riforma e la degradazione e sintesi dei substrati anafase ad es.

Please recommend JoVE to your librarian. Adattato da Murray 1. Le goccioline privo di nuclei generano oscillazioni mitotiche fino a 30 cicli undamped nell’arco di tempo di 92 ore, come indicato dal cellularre sintesi e degradazione di una fluorescenza reporter securin-mCherry Figura 2A.

Figura 2B Mostra autonoma alternanza di fasi di ciclo cellulare distinti, interfase barre blu e mitosi barre rossedurante il quale i cambiamenti della morfologia nucleare sono guidati dall’oscillatore mitotica autosostenuto.

Immagini sono state raccolte utilizzando il microscopio a fluorescenza multicanale time-lapse. Procedura sperimentale celkulare la generazione di cellule mitotiche basati su gocciolina. Mitosl un metodo di Vortex, gli estratti e l’olio di tensioattivo sono mescolati per generare goccioline. La rilevazione delle ,eiosi del ciclo cellulare utilizzando reporter fluorescenti.

Inserire figura mostra l’immagine di fluorescenza con la gocciolina selezionata incorniciata da bianco cerchio tratteggiato. Serie di istantanee di una gocciolina in fluorescenza canali le prime tre righe e campo luminoso ultima riga.

Buste di nucleare evidenziati da frecce bianche sono anche rilevabili nelle immagini campo luminoso, la localizzazione di GFP-NLS di corrispondenza indicato i nuclei. Abbiamo presentato un nuovo metodo per lo sviluppo di un sistema di alto-rendimento cellula artificiale che consente in vitro ricostituzione e il monitoraggio a lungo termine delle oscillazioni di ciclo cellulare auto-sostenuta a livello di singola meuosi.

Meiosi – Scienze Naturali

Ci sono diversi passaggi critici che rendono questo metodo successo. Mfiosi quinto luogo, la sigillatura dei tubi con olio impedirebbe flusso goccia. Questi insieme migliorare mfiosi tasso di successo della ricostruzione in vitro di robuste oscillazioni nelle goccioline e la precisione di segmentazione e rilevamento di queste gocce in un lungo termine.

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Per gli studi che richiedono una dimensione ben definita con variazione di dimensione ridotta a icona, microfluidica tecniche mekosi essere meiiosi per un migliore controllo delle dimensioni delle gocce. Qui, abbiamo scelto il metodo di Vortex sopra il metodo di microfluidica mitoai due motivi. In primo luogo, ha procedure semplici e facili da seguire, che consentirebbero laboratori senza avere accesso alle celoulare di microfluidica o nanofabbricazione di adattare questo metodo facilmente.

L’intervallo di dimensioni gocciolina generato con questo metodo corrisponde l’ampia gamma di formati di cella risultanti dalle divisioni caratteristiche riduttive delle cellule in fase di clivaggio di embrioni in anticipo come Xenopus e zebrafish.

Abbiamo dimostrato che questo metodo ha migliorato significativamente la durata della vita delle oscillazioni da pochi cicli in massa reazione 8 a oltre 30 cicli nel microambiente di goccioline Figura 2A. Inoltre, le reazioni alla rinfusa mancano la somiglianza con le dimensioni di cella effettivo e non possono ricapitolare l’organizzazione spaziale raggiunto di compartimentalizzazione funzionali in cellule vere.

Per evitare qualsiasi interferenza dalle complicate dinamiche nucleare, noi possiamo ricostituire un sistema minimale, solo citoplasmatica delle cellule-ciclo che non contiene nuclei. Questo oscillatore semplice e sola citoplasmico esibisce autosostenute oscillazioni significativamente migliore di alcuni oscillatori sintetiche esistenti.

La tecnica di Vortex permette per la generazione di goccioline con raggi in una vasta gamma, che saranno apprezzati lo studio della dimensione della cella dipendente da comportamenti dei cicli cellulari.

Chang e James E. You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account. Skip to content Biochemistry.

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Rimuovere il buffer cellulxre preparazione nucleare NPB e cicll i testicoli in pezzi con lunghezze inferiori a 0,2 cm utilizzando delle forbici affilate per dissezione in un ml di Petri. Aggiungere 8 mL di NPB freddo ai testicoli per ulteriore ripartizione. Rotazione verso il basso gli spermatozoi raccolti a 1. Rotazione verso il basso le cellule a Rotazione verso il basso le perline a x g per 5 min e aggiungere 10 mL di soluzione di lavaggio 25 mM Tris base, pH 7.

Misurare la concentrazione di proteina raccolta eseguendo un gel blu di Coomassie Iniettare la femmina matura tre Xenopus laevis con cilco UI cavalla incinta del siero di gonadotropina PMSG 10 giorni prima di deporre le uova. Iniettare queste rane Xenopus con UI di gonadotropina corionica umana HCG per indurre 18 ore prima della preparazione del mitowi estratti la deposizione delle uova.

Scartare le uova deposte durante la notte. Spremere le uova di ogni rana femmina in mm capsule di Petri contenente 10 mL di buffer di x MMR 0,2 cidlo esaminare sotto un microscopio stereo.

Scartare i lotti di uova che hanno poco chiari confini fra l’animale e vegetale poli o avere macchie bianche irregolari in cima a pali di animale. Scegliere il lotto di uova da una rana femmina che presenta una popolazione omogenea di uova con poli vegetale e animale chiaramente differenziate e trasferire le uova in un becher da mL.

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Lavare le uova con 1 L di soluzione di x MMR 0,2 oltre quattro volte. Scegliere e scartare le uova che diventano bianche usando una pipetta cidlo vetro. Utilizzare il lato di apertura di una pipetta di vetro per mescolare le uova delicatamente fino a quando le uova sono attivate e si rimuove la soluzione ionoforo del calcio.

Verificare l’efficienza di attivazione dopo uova stabilirsi nella parte inferiore del bicchiere. Trasferire con cautela le uova ad una microprovetta salvapercussore 0,4 mL e poi pack uova attraverso centrifugazione a x g per 60 secondi e poi x g per 30 secondi. Rimuovere il tampone extra sulla cima di uova usando un pipetta Pasteur di vetro per ridurre la diluizione degli estratti.

Schiacciare le uova a Tagliare i tubi con una lama di rasoio per separare tre strati di uova tritate e tenere il citoplasma grezzo nello strato intermedio. Centrifugare il citoplasma greggio nuovamente a Tenere gli estratti preparati sul ghiaccio. Usa il bordo affilato di una pietra per affilare, segnano i confini desiderati sulla superficie esterna del tubo di vetro con incisioni di luce, quindi applicare una leggera pressione su entrambi i lati delle incisioni di rompere i pezzi di cjclo di vetro.

Estrarre il blocco riscaldante e posizionarlo in un essiccatore sotto vuoto in policarbonato. Posare i tubi di vetro tagliato all’interno di un essiccatore sotto vuoto a circa 5 cm al blocco riscaldante. Collegare un essiccatore a una pompa a vuoto.

Accendere la pompa per un minuto raggiungere il livello di vuoto desiderato, quindi chiudere la valvola a 3 vie cicclo sigillare un essiccatore e lasciare che il vapore di silano tricloro 1h, 1h, 2H, 2h-perfluottani ricoprire la parete interna dei tubi di imtosi. Lasciare le provette di vetro all’interno di un essiccatore per rivestimento durante la notte.

I tubi saranno pronti per l’uso il giorno successivo. Imaging e generazione di goccia Nota: Le procedure di generazione di goccioline e di imaging sono illustrate nelle figure 1B e 1C.

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Generare w utilizzando un miscelatore vortex. Controllare visivamente se le gocce sono di dimensioni uniformi. Riempire un piatto fondo di vetro con un diametro di 40 mm con olio minerale. Immergere le provette piene di goccia in olio spingendo delicatamente verso il basso utilizzando una pinzetta bene.

Dopo il caricamento tutti i campioni, uso un bicchiere pipettare per rimuovere eventuali detriti visibili o trapelate di goccioline.

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Se i tubi non sono o non saranno completamente immersi nel processo di imaging, aggiungere altro olio minerale. Condurre la formazione immagine di goccioline su un microscopio a epifluorescenza dotato di un palco di x-y motorizzati Vedi Tabella materiali.

Utilizzare un obiettivo 4x aria per tutte le immagini. Segmento singole goccioline utilizzando il canale di campo luminoso. Applicare la soglia per l’immagine. Automaticamente traccia i segmenti tra fotogrammi adiacenti utilizzando l’algoritmo autoregressivo del movimento. Controllare visivamente che tutti i brani attraverso l’intero video per rilevare segmentazioni errati quel segmento di spazio vuoto tra gocce invece di goccioline effettive.

Eliminare manualmente le tracce non corrette. Analisi dei dati del periodo di dimensione e oscillazione della gocciolina Caricare i file “. Gocciolina melosi ID in un file “. Importare i file “. Calcolare il volume di una goccia compresso in base alle informazioni di zona gocciolina esportato dopo la segmentazione e l’altezza del vetro camera